| 公开(公告)号 | CN1320113C |
| 公开(公告)日 | 2007.06.06 |
| 申请(专利)号 | CN03129043.4 |
| 申请日期 | 2003.06.05 |
| 专利名称 | 一种利用大肠杆菌发酵制备小干扰RNA分子的方法 |
| 主分类号 | C12N15/10(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/10(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 复旦大学;上海复旦新杨生物科技有限责任公司;上海恒达科技发展股份有限公司 |
| 发明(设计)人 | 钱志康;宣宝琴;李 琳;徐剑锋;谭 畅;闵太善;王维荣;谢承光;沈水源;程小伟;史顺成;黄伟达 |
| 地址 | 200433上海市邯郸路220号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 上海正旦专利代理有限公司 |
| 代理人 | 陆 飞 |
| 国省代码 | 上海;31 |
| 主权项 | 一种制备RNAi用siRNA分子的方法，其特征在于包括构建长链dsRNA表达载体，并转化大肠杆菌宿主菌，通过工业化规模发酵，用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物；该混合物用CF-11柱进行纯化得到dsRNA；最后利用大肠杆菌RNase III将长链的dsRNA切成12-30bp的小干扰RNA；其中，构建在大肠杆菌中表达长链dsRNA的表达载体的方法如下：(1)将目的基因片段以相反的方向将基因的3’端连接到第三段DNA片段的两侧，然后克隆到带有一个T7启动子的载体中去；当把此表达质粒转化到能表达T7 RNA聚合酶的宿主菌内后，目的基因的正反两个方向的DNA链以及两者之间的第三段DNA链就能被依次转录，成为一条连续的RNA链；或者(2)利用带有大肠杆菌复制起点的表达载体，在合适的位置加入抗性基因和多克隆位点，并在多克隆位点两侧分别加入方向相对的两个启动子以及终止子，在多克隆位点中插入目的DNA片段后以正反两个方向转录RNA。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵大规模制备RNA干扰用小干扰RNA分子的新方法。本发明构建了长双链RNA表达载体，并转化大肠杆菌宿主菌，通过大规模发酵，用碱-SDS法抽提发酵菌体得到全RNA和质粒DNA的混合物。该混合物用CF-11柱进行纯化得到长双链RNA。最后利用大肠杆菌Ⅲ型RNA酶将长双链RNA切成12-30bp的小干扰RNA。得到的siRNA用分光光度法检测其纯度与浓度，OD260/OD280＝1.978，表明样品的纯度相当高。每100g大肠杆菌菌体得到siRNA样品约为210mg。 |
| 国际公布 |
