| 公开(公告)号 | CN1261566C |
| 公开(公告)日 | 2006.06.28 |
| 申请(专利)号 | CN200410005171.X |
| 申请日期 | 2004.02.11 |
| 专利名称 | 非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法 |
| 主分类号 | C12N9/12(2006.01)I |
| 分类号 | C12N9/12(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C07K16/06(2006.01)I;C07K16/40(2006.01)I;A61K38/45(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;G01N33/53(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 单保恩 |
| 发明(设计)人 | 马 洪;单保恩 |
| 地址 | 050011河北省石家庄市健康路12号河北医科大学第四医院科研中心 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 石家庄新世纪专利商标事务所有限公司 |
| 代理人 | 董金国 |
| 国省代码 | 河北;13 |
| 主权项 | 非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法，其特征在于它包括以下工艺步骤：A、细胞株及细胞培养：Sf21细胞株应用Grace′s培养基进行培养，将细胞调整到1×109/L的密度，用培养瓶于恒温摇床在转速为80-100转/分、温度26-28℃条件下进行培养，经胎盼蓝染色检测活细胞百分率应为95％-100％；B、应用Bac-to-Bac方法进行制备重组Syk基因的杆状病毒；C、纯化baconidSykDNA：应用脂质体介导技术，将转染Syk基因的Sf21细胞于28℃培养4-6天，用Gibco-BRL公司提供的cellfectin试剂进行选择培养，收集细胞制备SykDNA；应用噬菌体纯化法纯化病毒颗粒，经培养一些孔形成噬菌斑，将这些阳性培养孔细胞经SDS-PAGE检测Mr为72×103蛋白条带的存在；D、Sf21细胞的大量制备：于培养瓶中加入1L呈对数生长期的Sf21细胞悬液，每毫升细胞悬液中的含Sf21细胞1.0-1.2×106个，加入病毒贮存液，其病毒浓度约为2.5×108pfu/mL，于恒温摇床在80-100转/分、温度为28℃条件下培养48小时进行病毒感染和细胞增殖，其病毒感染率约为6；E、Syk的分离、纯化：收集细胞悬液进行低速离心，将细胞数量为2.5×109的细胞沉淀物与细胞裂解液共同培养30分钟，于冰浴中用超声波破碎仪振荡裂解3次，每次30秒，将细胞裂解液于4℃超速离心，收集上清液并过滤，将滤液加入由Sigma生产、规格为2.5×10cm的活化的Yellow-3层析柱，用两倍体积的缓冲液和1倍体积的含有200mmol/LNaCl的缓冲液冲洗层析柱。Syk蛋白用3.5倍体积的含200mmol/L-1mol/LNaCl的缓冲液洗脱。 |
| 摘要 | 本发明属于基因治疗领域，特别是指一种辅助乳腺癌诊断、治疗方案制定及估计预后的相关基因-非受体型酪氨酸蛋白激酶Syk的制备方法。主要包括细胞株及细胞培养、应用Bac-to-Bac方法进行制备重组Syk基因的杆状病毒、纯化baconid Syk DNA、Sf21细胞的大量制备、Syk的分离、纯化等工艺步骤。本发明解决了乳腺癌的早期诊断、治疗方案选择、病情复发和转移监测、疗效评价和预后估价以及群体随访观察和普查等方面的问题，具有工艺设计合理，可辅助乳腺癌诊断、治疗方案制定及估计预后等优点。 |
| 国际公布 |
