| 公开(公告)号 | CN1132844C |
| 公开(公告)日 | 2003.12.31 |
| 申请(专利)号 | CN98103307.5 |
| 申请日期 | 1998.07.24 |
| 专利名称 | 重组人白细胞介素—18的工程菌直至产物的制备方法 |
| 主分类号 | C07K14/54 |
| 分类号 | C07K14/54;C12N1/21;//C12N1/21,C12R1:19 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 吴光耀 |
| 发明(设计)人 | 吴光耀;刘祚昌 |
| 地址 | 100091北京市圆明园西路北京大学燕北园303楼406号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 北京北新智诚知识产权代理有限公司 |
| 代理人 | 郭佩兰 |
| 国省代码 | 北京;11 |
| 主权项 | 一种重组人白细胞介素-18(IL-18)工程菌直至产物的制备方法，其特征在于它包括以下几个步骤：①人外周血中白细胞的分离；②白细胞中总mRNA的分离；③人工合成含有限制性内切酶切点的引物，在合成的上游引物中导入EcoRI位点，在合成的下游引物中导入BamHI位点，其引物的序列为：PL5′CG GAATTC AAA ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA 3′PR3′GC GGATCC TTA GTC TTC GTT TTG AAC AG 5′④RT-PCR基因扩增：在含有合成引物的存在下，以mRNA为模板，通过RT-PCR基因扩增，获得IL-18基因片段，其核苷酸序列和相应的氨基酸序列为：10ATG TAC TTT GGC AAG CTT GAA TCT AAA TTA TCA GTC ATA AGAM Y F G K L E S K L S V I R20AAT TTG AAT GAC CAA GTT CTC TTC ATT GAC CAA GGA AAT CGGN L N D Q V L F I D Q G N R30 40CCT CTA TTT GAA GAT ATG ACT GAT TCT GAC TGT AGA GAT AATP L F E D M T D S D C R D N50GCA CCC CGG ACC ATA TTT ATT ATA AGT ATG TAT AAA GAT AGCA P R T I F I I S M Y K D S60 70CAG CCT AGA GGT ATG GCT GTA ACT ATC TCT GTG AAG TGT GAGQ P R G M A V T I S V K C E80AAA ATT TCA ACT CTC TCC TGT GAG AAC AAA ATT ATT TCC TTTK I S T L S C E N K I I S F90AAG GAA ATG AAT CCT CCT GAT AAC ATC AAG GAT ACA AAA AGTK E M N P P D N I K D T K S100 110GAC ATC ATA TTC TTT CAG AGA AGT GTC CCA GGA CAT GAT AATD I I F F Q R S V P G H D N120AAG ATG CAA TTT GAA TCT TCA TCA TAC GAA GGA TAC TTT CTAK M Q F E S S S Y E G Y F L130 140GCT TGT GAA AAA GAG AGA GAC CTT TTT AAA CTC ATT TTG AAAA C E K E R D L F K L I L K150AAA GAG GAT GAA TTG GGG GAT AGA TCT ATA ATG TTC ACT GTTK E D E L G D R S I M F T V158CAA AAC GAA GAC TAAQ N E D *⑤IL-18cDNA克隆和大肠杆菌转化：经EcoRI和BamHI酶切的pBV220载体和IL-18cDNA连接，并转化至感受态的大肠杆菌中，经抗性培养基筛选，得阳性克隆的大肠杆菌，即IL-18工程菌。⑥将工程菌扩增培养，热激表达、破壁、破包含体；IL-18纯化。 |
| 摘要 | 一种重组人白细胞介素-18(IL-18)的工程菌及其产物的制备方法，包括人白细胞分离，白细胞总mRNA分离；人工合成含有限制性内切酶切点的引物；RT-PCR基因扩增；IL-18 cDNA克隆；转化进入大肠杆菌；工程菌中产物高效表达；IL-18的纯化。由于采用含有限制性内切酶切点的引物，准确获得含有474个核苷酸的IL-18基因。使用大肠杆菌偏爱的终止密码子提高表达率、采用高扩增培养基，表达量高，使得一步纯化即可获得医用针剂纯的产品。 |
| 国际公布 |
