| 公开(公告)号 | CN1459505A |
| 公开(公告)日 | 2003.12.03 |
| 申请(专利)号 | CN02117369.9 |
| 申请日期 | 2002.05.21 |
| 专利名称 | 中国汉族人基质金属蛋白酶-9基因重构、表达、纯化及其医学应用 |
| 主分类号 | C12N15/63 |
| 分类号 | C12N15/63;C12N15/70;C12N9/50;C12N15/57;C12N1/21;C07K1/14;C12Q1/37;A61K38/48 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 赵平;胡敬群;蔡建强 |
| 发明(设计)人 | 胡敬群;杨建国 |
| 地址 | 100021北京市朝阳区潘家园南里17号中国医学科学院肿瘤医院 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | |
| 代理人 | |
| 国省代码 | 北京;11 |
| 主权项 | 一种表达纯化中国汉族人MMP-9 cDNA基因和重组PMMP-9的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)、克隆中国汉族人MMP-9的基因，用反转录PCR法扩增MMP-9的基因；(2)、将上述扩增的MMP-9基因与克隆载体连接，构建人MMP-9克隆质粒；(3)、将上述人MMP-9克隆质粒亚克隆进表达载体，再将连接后的质粒DNA转染大肠杆菌；(4)、表达中国汉族人MMP-9a、将上述带有中国汉族人MMP-9基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；(5)、纯化人MMP-9a、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；b、裂解细菌，离心取上清液；c、初步纯化人MMP-9；d、用离子交换和凝胶过滤层析进行纯化。(6)、重组中国汉族人PMMP-9基因的构建a、以MMP-9质粒DNA为模板以新引物作PCR扩增得到MMP-9的衍生物PMMP-9；b、将PCR产物PMMP-9克隆到克隆载体质粒上；c、经酶切将PMMP-9基因亚克隆到表达载体；(7)、重组中国汉族人PMMP-9蛋白的表达和纯化a、将上述带有重组中国汉族人PMMP-9基因的表达载体的大肠杆菌铺含有抗生素的LB培养基板，将板放置37℃温箱过夜培养；b、从板上选一个菌落，放入装LB培养基培养瓶内，在30℃摇箱内培养，测菌液A650 OD值为1.0时停止培养；c、向菌液内加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续培养6-8小时；d、收获细菌；e、将上述细菌沉淀用pH8.0的磷酸盐缓冲液洗一次，离心后，再用pH8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀；f、裂解细菌，离心取上清液；g、初步纯化重组人PMMP-9；h、用离子交换和Ni-NTG-His柱亲和层析进行纯化。 |
| 摘要 | 本发明涉及一种中国汉族人MMP-9基因的克隆、重组、表达、纯化方法与专用引物，以及MMP-9蛋白及其类似物、衍生物在肝癌临床诊断和治疗方面的应用。本方法将获得的中国汉族人肝细胞cDNA，用PCR方法(引物1为5′CATGAGCCTCTGGCAGCCCCT引物2为5′GACGGGAGCCCTAGTCCTCAG)获得人MMP-9基因，并将该基因重组后克隆到大肠杆菌表达载体中，诱导表达后提取MMP-9及其衍生物PMMP-9，进而应用离子交换柱层析和凝胶过滤纯化出MMP-9及其衍生物PMMP-9，为临床进一步观察肿瘤病人体内MMP-9水平的变化，奠定了物质基础。 |
| 国际公布 |
