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二 分光光度计结构简介
能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来，并测量其强度的仪器称为分光光度计。
分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段)光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测系统。
(一)光源
一个良好的光源要求具备发光强度高，光亮，稳定，光谱范围较宽和使用寿命长等特点。分光光度计上常用的光源有钨灯和氢灯（或氘灯)，前者适用于340～900nm范围的光源，后者适宜于200～360nm的紫外光区，为了使发出的光线稳定，光源的供电需要由稳压电源供给。
(二)单色器
单色器是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯波长的光线，通过此色散系统可根据需要选择一定波长范围的单色光，单色光的波长范围愈狭，仪器的灵敏性愈高，测量的结果愈可靠。
(三)狭缝
狭缝是由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射光的强度，并使入射光形成平行光线，以适应检测器的需要。分光光度计的缝隙大小是可调的。
(四)比色杯
比色杯也叫样品池、吸收器或比色皿，用来盛测定溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外光区测定时要用石英比色杯。
(五)检测系统
有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种，一是光电池，二是光电管。光电池的种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流较强，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间后会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一段时间才能恢复。因此使用时不宜长期照射，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物)做成，当光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中的电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，所以需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管，在光照射下产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟数字转换装置如数字式电压表等进行。
三 分光光度技术的应用
(一)测定溶液中物质的含量
利用分光光度法对物质进行定量测定的方法，主要有以下几种：
１．直接比较法（标准管法) 可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。这需要测定标准溶液（浓度已知的溶液)和未知液（浓度待测定的溶液)的吸光度，将两者进行比较。由于所用的吸收池的厚度是一样的，可用下式进行计算。
C测=A测/A标×C标
式中C测代表未知液的浓度，C标代表标准液的浓度，A测和A标分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值，式中只有是C测未知的，可由上式计算得之。
含量测定时通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处：①灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异；②可以避免其他物质的干扰。
２．标准曲线法（适合成批试样分析) 用已知浓度的标准溶液，配制成一系列不同浓度的标准溶液，在最大吸收波长（λmax)处测得各个吸光度（Ａ值)，以Ａ为纵坐标，浓度为横坐标，作标准曲线，（绘制A-C曲线)取其直线部分作定量依据。在测定被测样品时，以相同条件在λmax处测定A值，再从标准曲线上查得该样品的相应浓度。
标准曲线制作与样品管的测定，应在同一仪器上进行，在配制样品时，一般选择其浓度相当于标准曲线中部的浓度较好。
在实验条件比较恒定，样品数量多的测定中，标准曲线法是十分方便准确的。但绘制好的标准曲线仅供在同样条件下处理的被测溶液使用。因为测定值与标准曲线之间会因仪器性能、试剂的批号及温度、时间等不同而有所变化。为此，标准曲线要经常检查校正。其方法是配制的已知浓度的标准液，按原标准曲线的处理显色，测得吸光度值，然后比较由标准曲线查出的浓度与已知浓度差值，若差值在实验要求的允许范围内，标准曲线仍可使用，超出则需要重新绘制。为校正的方便，标准曲线绘制完毕后，应在坐标纸上注明测定内容，仪器型号和波长，绘制日期等。
(二)用紫外光谱鉴定化合物
使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度，然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度—波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。
各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线形状一样时，则很可能它们是同一物质。一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低谷的波长是一定不变的。
紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况处，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。紫外光吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。
