胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途

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公开(公告)号	CN1940074A
公开(公告)日	2007.04.04
申请(专利)号	CN200610069659.8
申请日期	2006.08.07
专利名称	胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体的构建、筛选及其用途
主分类号	C12N15/63(2006.01)I
分类号	C12N15/63(2006.01)I;C12N15/11(2006.01)I;C07H21/02(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I
分案原申请号
优先权
申请(专利权)人	汪运山
发明(设计)人	汪运山;胡安拉;马晓丽;朱之炜;肖东杰;孙善会;郏雁飞;周芳
地址	250013山东省济南市历下区解放路105号中心医院
颁证日
国际申请
进入国家日期
专利代理机构	济南金迪知识产权代理有限公司
代理人	王绪银
国省代码	山东;37
主权项	靶向AFP基因的siRNAs表达载体，其特征是，以pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector为载体，针对甲胎蛋白(AFP)基因编码区上、中、下游的三段序列，在可特异表达AFP的人胃腺癌细胞株FU97中发挥RNA干扰作用，这三段AFP特异性RNA干涉靶序列分别为：①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’，起始于508位；②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’，起始于968位；③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，起始于1474位，是用于与AFP相关的胃癌的治疗性物质，由以下方法制得： (1)RNA干涉靶序列的选择及插入序列的设计与合成选择AFP基因编码区的三段序列①5’-CAGGGAGACATTCATGAAC-3’、②5’-CTGGAACGTGGTCAATGTA-3’、③5’-GGCTGACATTATTATCGGA-3’，设计并分别体外合成两段互补的寡核苷酸序列，序列如下： ①AFP寡核苷酸序列1：正义链5’gatccGCAGGGAGACATTCATGAACTTCAAGAGAGTTCATGAATGTCTCCCTGTTTTTTACGCGTg3’ 反义链5’aattcACGCGTAAAAAACAGGGAGACATTCATGAACTCTCTTGAAGTTCATGAATGTCTCCCTGCg3’ ②AFP寡核苷酸序列2：正义链5’gatccGCTGGAACGTGGTCAATGTATTCAAGAGATACATTGACCACGTTCCAGTTTTTTACGCGTg3’ 反义链5’aattcACGCGTAAAAAACTGGAACGTGGTCAATGTATCTCTTGAATACATTGACCACGTTCCAGCg3’ ③AFP寡核苷酸序列3：正义链5’gatccGGCTGACATTATTATCGGATTCAAGAGATCCGATAATAATGTCAGCCTTTTTTACGCGTg3’ 反义链5’aattcACGCGTAAAAAAGGCTGACATTATTATCGGATCTCTTGAATCCGATAATAATGTCAGCCg3’ (2)将上述合成的寡核苷酸分别与线性载体pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector连接、转化、扩增及质粒的提取首先用TE缓冲液重悬AFP寡核苷酸1/2/3干粉，上下游序列以1∶1混合，95℃30秒，72℃2分钟，37℃2分钟，25℃2分钟完成退火；然后将退火后的双链寡核苷酸与pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在氨苄青霉素抗性平板上筛选，将单克隆阳性重组子小量扩增，再用质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA； (3)质粒的鉴定质粒DNA琼脂糖凝胶电泳，紫外分光光度计分析测定质粒DNA的浓度和纯度，并进行插入片断测序，以确定合成的寡核苷酸是否已正确转入pSIREN-DNR-DsRed-Express DonorVector质粒中。
摘要	一种胃癌靶向AFP基因的siRNAs表达载体构建、筛选及其用途。本发明以利用RNA干涉技术为主，针对AFP基因的不同靶序列，构建了三个能在哺乳动物细胞中表达shRNA的表达质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNAl、pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA2和pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector-AFP-siRNA3，能高效的特异性的抑制AFP基因表达，可用于制备治疗分泌AFP的胃癌的基因药物。
国际公布