| 公开(公告)号 | CN1936012A |
| 公开(公告)日 | 2007.03.28 |
| 申请(专利)号 | CN200610019800.3 |
| 申请日期 | 2006.08.03 |
| 专利名称 | 一种抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶V的shRNA表达载体的构建方法及应用 |
| 主分类号 | C12N15/79(2006.01)I |
| 分类号 | C12N15/79(2006.01)I;C07H21/04(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 武汉大学 |
| 发明(设计)人 | 章晓联;李冬青 |
| 地址 | 430072湖北省武汉市武昌珞珈山 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 武汉宇晨专利事务所 |
| 代理人 | 王敏锋 |
| 国省代码 | 湖北;42 |
| 主权项 | 一种抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶V的shRNA真核表达载体的构建方法，其特征是包括下列步骤： A.根据Genebank提供的MGAT5的基因序列，从编码区中选取第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG为靶序列，设计并合成引物，引物为： siRNA1-Oligo1：5’-TCGGGCTTCAAGATTGCGGTTCA-3’ siRNA1-Oligo2：5’-AGCTTGAACCGCAATCTTGAAGCCCGAGGCC-3’ siRNA1-Oligo3：5’-AGCTTCCGCAATCTTGAAGCCCGATTTTTT-3’ siRNA1-Oligo4：5’-AATTAAAAAATCGGGCTTCAAGATTGCGGA-3’ siRNA2-Oligo1：5’-AAGATTGAGCCGTATATGCCATTCA-3’ siRNA2-Oligo2：5’-AGCTTGAATGGCATATACGGCTCAATCTTGGCC-3’ siRNA2-Oligo3：5’-AGCTTTGGCATATACGGCTCAATCTTTTTT-3’ siRNA2-Oligo4：5’-AATTAAAAAAGATTGAGCCGTATATGCCAA-3’ B.将载体psilencer1.0-U6经ApaI、HindIII双酶切，用回收试剂盒回收； C.siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火，用双蒸水稀释引物至20pmol/μl，取siRNA1-up与siRNA1-down各2μl，加水补至20μl，95℃ 2～8分钟，55℃ 10～20分钟，冷却至室温，siRNA2-Oligo1与siRNA2-Oligo2退火方式与本步骤相同； D.取1μl siRNA1-Oligo1与siRNA1-Oligo2退火退火产物，加入1μlpsilencer1.0-U6经ApaI、EcoRI双酶切回收后的产物，1μl T4连接酶和2μl 10×连接缓冲液，加双蒸水补至20μl体系，置于4℃反应过夜，siRNA2-Oligo1与siRNA2-Oligo2退火产物的连接方法与本步骤相同； E.将步骤D所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α，取连接产物10μl，加入100μl DH5α感受肽细胞，冰浴30分钟，42℃ 90秒，再冰浴5分钟，加入800μl LB液体培养基，37℃，225rpm振摇40～50分钟，取200μl菌液均匀涂在有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，37℃培养过夜； F.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基培养过夜； G.提取步骤F获得的菌液的质粒DNA； H.所提质粒DNA经ApaI、HindIII酶切鉴定，选出正确质粒，此质粒再经ApaI、EcoRI双酶切、回收，按步骤D的方法与siRNA1-Oligo3与siRNA1-Oligo4退火退火产物连接； I.将步骤H所得的连接产物按步骤E的方法转化至大肠杆菌DH5α； J.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基培养过夜，提取菌液的质粒DNA； K.所提质粒DNA经ApaI、HindIII、EcoRI酶切鉴定，选出质粒，为shRNA1-Mgat5。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种抑制N-乙酰葡萄糖胺转移酶V的shRNA真核表达载体的构建方法及应用，其步骤是根据Genebank提供的MGAT5的基因序列，选取编码区第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG为靶序列设计并合成引物，通过引物退火，连接至载体psilencer1.0-U6，得到真核表达载体shRNA1-Mgat5，将shRNA1-Mgat5转染至乳腺癌细胞MA782，能明显抑制MA782细胞在小鼠体内生长，该质粒在制备治疗或预防乳腺癌的药物中的应用，前景广泛。 |
| 国际公布 |
