| 公开(公告)号 | CN1221567C |
| 公开(公告)日 | 2005.10.05 |
| 申请(专利)号 | CN02134404.3 |
| 申请日期 | 2002.07.19 |
| 专利名称 | 生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法 |
| 主分类号 | C07K14/435 |
| 分类号 | C07K14/435;C12N15/09;C12P21/02 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 广州铭康生物工程有限公司 |
| 发明(设计)人 | 刘龙斌;杨琴;王敏荣;王军志 |
| 地址 | 510730 广东省广州市经济技术开发区友谊路173号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 广州知友专利代理有限公司 |
| 代理人 | 邵毓琴 |
| 国省代码 | 广东;44 |
| 主权项 | 生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，依次包括以下步骤：(1)定点突变天然t-PA获得含突变位点的TNK-tPA突变体基因；(2)构建表达载体pCdhfr；(3)以XhoI/XbaI双酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的7Kb的DNA片段，与以XhoI/XbaI双酶切的真核表达载体pCdhfr连接，转化大肠杆菌E.coliJM109，以载体上的通用引物做PCR初步筛选克隆，取阳性克隆株培养，得到重组表达质粒pCdhfr-mt-PA；(4)以TNK-tPA突变体表达质粒pCdhfr-mt-PA转染CHO-DHFR-细胞，经克隆和筛选获得高水平表达TNK-tPA的工程细胞株；(5)利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经分离纯化获得rhTNK-tPA突变体。 |
| 摘要 | 本发明公开了一种生产重组人组织型纤溶酶原激活剂TNK突变体的工艺方法，该方法采用全长基因合成的方法合成含上述突变位点的TNK-tPA基因，在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)中表达，经克隆和筛选获得高水平表达TNK-tPA的工程细胞株，利用细胞培养生物反应器持续培养工程细胞，收集细胞培养上清，经一系列柱层析分离纯化技术，获得rhTNK-tPA制品。本发明的目的基因在细胞中的表达水平高达18000IU/106cell/d，由此制备的rhTNK-tPA的单链比例高达80％以上，纯度高达95％以上；对于工业化规模而言，本发明所需的设备相对比较简单，成本低，工艺条件简单。 |
| 国际公布 |
